El síndrome de Werner (SW), causado por mutaciones en el gen WERNER (WRN) que codifica la helicasa RecQ, es una enfermedad clásica de envejecimiento acelerado, donde los pacientes sufren de varias disfunciones metabólicas sin cura. Si bien, como informamos previamente, la depleción de NAD+ causa la acumulación de mitocondrias dañadas, lo que conduce a un metabolismo comprometido, se desconocía cómo cambia el NAD+ mitocondrial en el SW y el impacto en las patologías del SW.
El síndrome de Werner (SW), una enfermedad de envejecimiento acelerado causada por mutaciones en el gen WRN, se presenta con diversas disfunciones metabólicas y una característica distintiva de envejecimiento prematuro. Este artículo de investigación investiga el papel de la disminución de NAD+ mitocondrial en el SW y su impacto en la proliferación celular, una característica clave afectada por la enfermedad.
El estudio comienza destacando la importancia del gen WRN en el mantenimiento de la salud celular, enfatizando su papel en la reparación del ADN y la estabilidad genómica. La pérdida de WRN funcional conduce a una reparación del ADN comprometida, agotamiento de los telómeros, senescencia prematura, defectos en el ciclo celular y una mitofagia comprometida. Además, el estudio se basa en investigaciones anteriores que demuestran que el agotamiento de NAD+ contribuye a las características de envejecimiento acelerado del SW.
Para investigar los mecanismos de desregulación de NAD+ en el SW y su efecto en la proliferación, los investigadores examinaron la regulación subcelular del metabolismo de NAD+ en modelos celulares de SW. Sus hallazgos indican un metabolismo de NAD+ comprometido en el SW, con el aumento de NAD+ disminuyendo la senescencia tanto en células madre mesenquimales (MSC) de SW como en fibroblastos primarios.
El estudio profundiza luego en el impacto de la deficiencia de WRN en las vías celulares. Utilizando datos de secuenciación de ARN de MSC deficientes en WRN, los investigadores identificaron alteraciones significativas en las vías metabólicas y de función mitocondrial, incluyendo la vía de la pentosa fosfato, la fosforilación oxidativa y el metabolismo del piruvato. También se interrumpieron las vías relacionadas con la proliferación. Notablemente, el tratamiento con ribósido de nicotinamida (NR), un precursor de NAD+, rescató múltiples vías en células deficientes en WRN, lo que sugiere que el tratamiento con NR se dirige a las mitocondrias en estas células. Este hallazgo respalda investigaciones anteriores que muestran la restauración de la proliferación de células madre después del tratamiento con NR o NMN en un modelo de Drosophila de SW.
El estudio explora además la correlación entre el metabolismo de NAD+ y la senescencia celular. El análisis de mapas de calor de genes expresados diferencialmente relacionados con la proliferación y el metabolismo de NAD+ reveló una agrupación de células deficientes en WRN, que fue parcialmente restaurada por el tratamiento con NR. La expresión de genes relacionados con NAD+ como NAMPT y NADSYN1 se correlacionó positivamente con genes pro-senescencia y negativamente con genes asociados a la proliferación. Por el contrario, NMNAT1-2 se correlacionó negativamente con genes pro-senescencia y positivamente con genes asociados a la proliferación. Estos resultados sugieren un vínculo regulador entre los genes relacionados con NAD+ y la proliferación.
Para validar los resultados de la secuenciación de ARN, los investigadores evaluaron el efecto del tratamiento con NR en los marcadores de senescencia en MSC de control y deficientes en WRN y en fibroblastos primarios. Observaron una disminución de la senescencia, medida por la tinción SA-β-Gal, en las MSC deficientes en WRN después del tratamiento con NR, pero no en las MSC de control. Además, la tinción SA-β-Gal aumentó en los fibroblastos derivados de pacientes con SW en comparación con los controles sanos, lo que indica una senescencia acelerada. Curiosamente, el tratamiento con NR disminuyó los marcadores de senescencia en los fibroblastos de SW, como lo indica una disminución significativa del área positiva para β-Gal y un aumento significativo de las células con localización nuclear de HMGB1. Estos hallazgos sugieren que WRN es esencial en la inhibición de la proliferación y la senescencia, mientras que la reposición de NAD+ disminuyó la senescencia en las MSC y los fibroblastos primarios.
El estudio luego investiga la regulación de las proteínas relacionadas con la síntesis de NAD+ en células HEK293 con silenciamiento génico de WRN (WRN-KD). Los investigadores confirmaron la eficiencia del silenciamiento génico de WRN y encontraron que el nivel de expresión de NMNAT1 era significativamente menor en las células WRN-KD. Los niveles de proteína de NAMPT y NADSYN1 aumentaron significativamente en las células WRN-KD. El tratamiento con NR no afectó la expresión de NMNAT1 o NADSYN1 en células de control o WRN-KD. Estos hallazgos sugieren que la pérdida de WRN resulta en una desregulación de la maquinaria de NAD+.
Para comprender la posible co-regulación de WRN y NMNAT, los investigadores exploraron conjuntos de datos de secuenciación de ChIP de la base de datos de objetivos del factor de transcripción ENCODE. Su análisis mostró que WRN comparte numerosos objetivos de transcripción con los tres NMNAT, incluidos reguladores de la cromatina, reguladores transcripcionales y modificadores de histonas. Estos resultados sugieren que el eje de co-regulación entre WRN y los NMNAT es importante para la estabilidad de la cromatina y el mantenimiento del ADN.
El estudio luego examina el impacto de la deficiencia de WRN en NAD+ mitocondrial. Utilizando células HEK293 que expresan establemente mito-EGFP-PARP1cd-myc (mitoPARP), una proteína PARP1 localizada en la mitocondria, los investigadores midieron el NAD+ mitocondrial indirectamente mediante la evaluación de la PARilación. Observaron una disminución significativa en la señal PAR, lo que indica una disminución de NAD+ mitocondrial, en las células WRN-KD en comparación con las células de control. Este hallazgo sugiere una alteración de NAD+ mitocondrial además del metabolismo de NAD+ celular.
El estudio investiga si el aumento de NAD+ mitocondrial puede rescatar los defectos de proliferación en las células WRN-KD. Examinaron el efecto del tratamiento con NR y la sobreexpresión de SLC25A51, un transportador de NAD+ mitocondrial, en la proliferación celular utilizando un ensayo de formación de colonias. Los resultados mostraron que WRN-KD condujo a una disminución de la formación de colonias en las células HEK293. Sin embargo, ni el tratamiento con NR ni la sobreexpresión de SLC25A51 restauraron la proliferación celular en las células WRN-KD. Estos resultados indican que los defectos de proliferación observados en las células WRN-KD no pueden ser rescatados aumentando NAD+ celular o aumentando la posible importación de NAD+ en las mitocondrias.
Se realizaron experimentos adicionales para comprender el efecto tanto del tratamiento con NR como de la sobreexpresión de SLC25A51 en los niveles de proteína de las proteínas relacionadas con el metabolismo de NAD+. Los resultados mostraron que ni NR ni la sobreexpresión de SLC25A51 afectaron la expresión de NMNAT1. La expresión de NADSYN1 aumentó en las células de control con sobreexpresión de SLC25A51, y NAMPT aumentó tanto en las células de control como en las WRN-KD con sobreexpresión de SLC25A51. Estos hallazgos sugieren que el NAD+ mitocondrial no es suficiente para rescatar la proliferación en las células HEK293 agotadas de WRN.
La sección de discusión resume los hallazgos clave del estudio, enfatizando la importancia del metabolismo de NAD+ en el SW y el envejecimiento. El estudio demuestra que la pérdida de WRN interrumpe el metabolismo de NAD+, lo que lleva a una disminución de NAD+ mitocondrial y una proliferación deteriorada. El estudio también destaca las limitaciones, incluido el uso de células inmortalizadas y los desafíos para trabajar con fibroblastos de SW. El estudio concluye que, si bien NAD+ es fundamental para la esperanza de vida y la salud de los modelos de SW, NAD+ por sí solo podría no ser suficiente para tratar todas las características distintivas del SW. Se necesitan estudios futuros para comprender la regulación subcelular del metabolismo de NAD+ in vivo y en células primarias.
Esta investigación revela una conexión crucial entre el síndrome de Werner (SW), el agotamiento de NAD+ mitocondrial y la disfunción celular. Si bien la suplementación con NAD+ puede mitigar la senescencia y mejorar los perfiles metabólicos, no es suficiente para restaurar la proliferación en células deficientes en WRN, lo que destaca el papel indispensable de WRN. Comprender esta compleja interacción ofrece vías prometedoras para el desarrollo terapéutico dirigido al SW y a los trastornos relacionados con el envejecimiento, lo que subraya la necesidad de una investigación más profunda sobre los mecanismos que rigen el metabolismo de NAD+ y su impacto en la salud celular.
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